La búsqueda de unos locales adecuados para el ejercicio de las obligaciones de representación de los Embajadores constituyó siempre un espinoso problema, especialmente al final del siglo XVI, cuando el protocolo y la imagen se convirtieron en un elemento crucial del lenguaje político papal. Por ello la decisión de elegir una sede permanente fue una innovación española en el ámbito de la acción diplomática romana y europea.

El Palacio fue alquilado en 1622, siendo el Duque de Alburquerque el primer embajador español que allí reside. Posteriormente el VIII Conde de Oñate lo compra en 1648, pagando por el mismo 22.000 escudos de la época, que se complementaron con un préstamo de 14.000 escudos para su restructuración que le concedió el Hospital de Santiago de los Españoles. En 1654 la Corona española lo adquiere del Conde de Oñate, nombrado Virrey de Nápoles.

La verdadera historia de la Embajada se articula con los embajadores que trabajaron por y para la diplomacia española ante la Santa Sede. Muchos de ellos, promovieron y apoyaron la causa de proclamación de numerosos santos españoles, colaboraron en la organización de las diócesis de los virreinatos de América, negociaron concordatos y protagonizaron decisiones tan importantes como la disolución de la Compañía de Jesús en 1774, culminación del regalismo.

La lista de los más de 160 embajadores permanentes incluye desde un Garcilaso de la Vega (padre del famoso poeta), a finales del siglo XV, hasta personalidades de primer orden en la política y administración española. No en vano fue Roma, durante siglos, una de las únicas dos representaciones que tenían rango de Embajada (siendo la otra París). Pasaron por ella Presidentes del Consejo de Ministros, Secretarios de Estado y Ministros: los dos Cardenales Acquaviva, el Conde de Aranda y Juan Nicolás de Azara, en el XVIII; Martínez de la Rosa, Cea Bermúdez, Cánovas del Castillo, el Conde de San Luís, el Marqués de Pidal, en el XIX; en el siglo XX, Ministros como Luis de Zulueta, Joaquín Ruiz Jiménez o Antonio Garrigues y destacados diplomáticos como Ángel Sanz Briz, Justo de las Naciones. En el 2011 se nombró a la primera mujer Embajadora ante la Santa Sede.