La verdadera historia de la Embajada se articula con los embajadores que trabajaron por y para la diplomacia española ante la Santa Sede. Muchos de ellos, promovieron y apoyaron la causa de proclamación de numerosos santos españoles, colaboraron en la organización de las diócesis de los virreinatos de América, negociaron concordatos y protagonizaron decisiones tan importantes como la disolución de la Compañía de Jesús en 1774, culminación del regalismo.
La lista de los más de 160 embajadores permanentes incluye desde un Garcilaso de la Vega (padre del famoso poeta), a finales del siglo XV, hasta personalidades de primer orden en la política y administración española. No en vano fue Roma, durante siglos, una de las únicas dos representaciones que tenían rango de Embajada (siendo la otra París). Pasaron por ella Presidentes del Consejo de Ministros, Secretarios de Estado y Ministros: los dos Cardenales Acquaviva, el Conde de Aranda y Juan Nicolás de Azara, en el XVIII; Martínez de la Rosa, Cea Bermúdez, Cánovas del Castillo, el Conde de San Luís, el Marqués de Pidal, en el XIX; en el siglo XX, Ministros como Luis de Zulueta, Joaquín Ruiz Jiménez o Antonio Garrigues y destacados diplomáticos como Ángel Sanz Briz, Justo de las Naciones. En el 2011 se nombró a la primera mujer Embajadora ante la Santa Sede.