La ricerca di spazi adeguati per l'esercizio degli obblighi di rappresentanza degli ambasciatori è sempre stato un problema spinoso, specialmente alla fine del XVI secolo, quando il protocollo e l'immagine divennero un elemento cruciale del linguaggio politico papale. Pertanto, la decisione di scegliere una sede permanente è stata un'innovazione spagnola nel campo dell'azione diplomatica romana ed europea.

Il palazzo venne affittato nel 1622, con il duca di Albuquerque che fu il primo ambasciatore spagnolo a risiedervi. Successivamente, l'VIII Conte di Oñate lo acquistò nel 1648, pagando gli stessi 22.000 stemmi dell'epoca, che furono completati da un prestito di 14.000 scudi per la sua ristrutturazione concessogli dall'Ospedale di Santiago de los Españoles. Nel 1654 la Corona spagnola la acquisì dal Conte di Oñate, nominato viceré di Napoli.

La vera storia dell'Ambasciata si articola con gli ambasciatori che hanno lavorato per la diplomazia spagnola presso la Santa Sede. Molti di loro promossero e sostennero la causa della proclamazione di numerosi santi spagnoli, collaborarono all'organizzazione delle diocesi dei vicereami d'America, negoziarono concordati e guidarono decisioni importanti come la dissoluzione della Compagnia di Gesù nel 1774, il culmine del realismo.

L'elenco di oltre 160 ambasciatori permanenti comprende di tutto, da un Garcilaso de la Vega (padre del famoso poeta) alla fine del XV secolo, a personalità di spicco della politica e dell'amministrazione spagnola. Non per niente Roma è stata, per secoli, una delle uniche due rappresentazioni ad avere il grado di Ambasciata (l'altra era Parigi). La attraversarono Presidenti del Consiglio dei ministri, Segretari di Stato e Ministri; i due Cardinali Acquaviva, il Conte di Aranda e Juan Nicolás de Azara, nel XVIII secolo; Martínez de la Rosa, Cea Bermúdez, Cánovas del Castillo, il Conte di San Luis, il Marchese di Pidal, nel XIX secolo; nel XX secolo, Ministri come Luis de Zulueta, Joaquín Ruiz Jiménez o Antonio Garrigues e diplomatici di spicco come Ángel Sanz Briz, Giusto delle Nazioni. Nel 2011 è stata nominata la prima donna Ambasciatrice presso la Santa Sede.